Vedecké správy: PCR testy na ebolu prinášajú protichodné výsledky
Generálny riaditeľ WHO Tedros Adhanom Ghebreyesus uviedol, že Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) k 3. júnu 2026 potvrdila 344 prípadov infekcie ebolou a 60 úmrtí v KDR, pričom počet podozrivých prípadov klesol na 116
„V Konžskej demokratickej republike WHO potvrdila 344 prípadov infekcie ebolou a 60 úmrtí. Počet podozrivých prípadov sa však znížil na 116,“ povedal na tlačovej konferencii v Ženeve.
WHO však stále hodnotí riziko šírenia choroby na národnej úrovni ako veľmi vysoké, na regionálnej úrovni ako vysoké a na globálnej úrovni ako nízke, poznamenal šéf organizácie.
Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) vyhlásila vypuknutie eboly v Konžskej demokratickej republike a Ugande za stav núdze v oblasti verejného zdravia, ktorý predstavuje riziko pre ďalšie krajiny. Predchádzajúce vypuknutie v Konžskej demokratickej republike sa skončilo v októbri 2025.
Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) odporúča používanie určitých diagnostických metód pre vírus Ebola vrátane polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou transkripciou (RT-PCR).
Vedecké správy
Článok spojený s americkou armádou publikovaný v časopise Scientific Reports v roku 2023 ukázal, že výsledky testov RT-PCR na ebolu sa líšili v závislosti od toho, ako boli navrhnuté syntetické priméry a sondy – tie isté ľudské vzorky boli v jednej konfigurácii PCR negatívne a v inej pozitívne.
PCR testy sa v súčasnosti používajú na počítanie prípadov eboly, ktoré vlády používajú na odôvodnenie lockdownov a iných autoritárskych reakcií na epidémie.
Štúdia, ktorú vykonali výskumníci z Lekárskeho výskumného ústavu infekčných chorôb americkej armády (USAMRIID) a ktorú čiastočne financovala Agentúra pre zníženie obranných hrozieb (DTRA), priamo spochybňuje myšlienku, že PCR testovanie na ebolu je fixný, stabilný alebo nezávisle samovalidujúci sa diagnostický systém.
Štúdia bola financovaná v rámci nasledujúcich cieľov:
Agentúra pre znižovanie obranných hrozieb (DTRA) a Divízia pre dohľad nad zdravím ozbrojených síl (AFHSD), Globálny dohľad nad novými infekciami (GEIS).
Podľa článku:
„Porovnanie výkonnosti nového testu s predchádzajúcimi testami na paneli vzoriek ľudského EBOV ukázalo zvýšenú citlivosť testu, čo sa prejavilo znížením hodnôt Cq pri detekcii troch pozitívnych testov, ktoré boli v pôvodnom teste negatívne.“
Inými slovami, tie isté ľudské vzorky poskytli nekonzistentné výsledky testov na ebolu v závislosti od použitej konfigurácie syntetického primeru/sondy.
V článku sa opakovane uvádza, že malé nezrovnalosti v sekvenciách medzi primermi/sondami testu a cieľovými protilátkami proti ebole významne zmenili výsledky testov proti ebole.
Podľa štúdie:
„Nezhody v sekvencii primeru alebo sondy a cieľovom organizme môžu viesť k zníženej citlivosti, zlyhaniu testu a falošne negatívnym výsledkom.“
Výskumníci zistili, že len jeden alebo dva nukleotidové nesúlady dramaticky zmenili správanie amplifikácie.
V článku sa uvádza:
„Jedna alebo dve nezhody kapsuly alebo sondy viedli k zníženiu citlivosti z minimálnej na takmer dva logaritmy.“
Štúdia tiež uviedla:
„Jeden nesúlad medzi primerom a templátom mal malý vplyv (zmena Cq < 0,5) na citlivosť testu, zatiaľ čo dva nesúlady viedli k významnému vplyvu (zmena Cq > 4,5).“
PCR amplifikácia je exponenciálna, čo znamená, že posun o 4,5 cyklu je významný.
V článku sa uvádzalo:
Reverzný primer v reverznom teste Ebo-TM (G18A) mal dva nesúlady pre Kikwit a Makona, čo viedlo k významnému zníženiu citlivosti pri 4,9 a 4,55 Cq.
Štúdia tiež uznáva, že skoré systémy PCR pre ebolu boli pôvodne navrhnuté s použitím neúplných genomických predpokladov.
Podľa článku:
„testy vyvinuté v tom čase s využitím obmedzených dostupných genomických informácií“
Výskumníci uznali, že následné sekvenovanie ohnísk odhalilo ďalšiu rozmanitosť v sekvenciách eboly, ktorá by mohla spochybniť tieto predchádzajúce analýzy.
V článku sa uvádza:
„Rýchle genomické sekvenovanie použité počas epidémie odhalilo genomickú diverzitu, ktorá by mohla negatívne ovplyvniť predtým vyvinuté testy.“
Štúdia opakovane varuje, že údajne „neobjavená“ sekvenčná diverzita by mohla viesť k úplnému strateniu vzoriek pozitívnych na ebolu.
Podľa článku:
„Zvýšené riziko falošne negatívnych výsledkov testov v dôsledku neobjavenej genetickej diverzity.“
Výskumníci potom sami upravili pravidlá molekulárnej detekcie, prepracovali priméry a sondy a zaviedli „degenerované nukleotidy“ na zlepšenie zhody sekvencií.
Podľa štúdie:
„Prepracovali sme test Ebo-TM tak, aby zohľadňoval všetky zavedené odchýlky EBOV v cieľovej oblasti testu vrátane degenerovaných nukleotidov, aby sme zmiernili vplyv nezrovnalostí na výsledky testu.“
Revidovaná analýza bola potom výpočtovo validovaná oproti sekvenčným databázam.
Podľa článku:
Analýza in silico ukázala 100 % zhodu s 99,7 % všetkých sekvencií EBOV v GenBank.
V článku sa tiež uvádza, že revidovaná analýza bola založená iba na „všetkých známych“ variantoch eboly.
Podľa štúdie:
„Inkluzívne testovanie ukázalo, že nový test EBO-TM2 detekoval všetky známe varianty EBOV.“
Formulácia „všetko je známe“ je dôležitá, pretože implicitne uznáva, že ďalšia neobjavená sekvenčná diverzita by mohla v budúcnosti opäť podkopať súčasné analýzy – rovnako ako novoobjavená sekvenčná diverzita podkopala tie predchádzajúce.
Štúdia tiež naznačuje, že zmiešané sekvencie v samotných vzorkách môžu zmeniť správanie amplifikácie.
Podľa článku:
„Malá populácia vírusov v kmeni EBOV Mayinga môže mať varianty zachytené v primeroch G14A a G18A, čo by viedlo k malému zlepšeniu účinnosti amplifikácie.“
Kriticky, hoci článok naznačuje, že revidovaná analýza bola presnejšia, štúdia nikdy nezávisle nepreukázala, ktorý výsledok testu bol v prípade sporných ľudských vzoriek skutočne správny.
To znamená, že článok nikdy nezávisle nestanovil, či bola pôvodná analýza chybná, či bola chybná aj revidovaná analýza, alebo či rozdielne pozitívne a negatívne výsledky Eboly boli jednoducho artefaktmi meniacich sa predpokladov PCR primerov a sond.
Čo článok priamo ukázal:
- Jedna konfigurácia analýzy priniesla negatívne výsledky,
- Ďalšia konfigurácia analýzy priniesla pozitívne výsledky,
- a tie isté ľudské vzorky zmenili diagnostickú klasifikáciu v závislosti od toho, ako bol navrhnutý samotný PCR systém.
Článok v konečnom dôsledku vykresľuje RT-PCR testovanie na Ebolu ako vysoko sekvenčne závislý molekulárny detekčný proces, ktorého výsledky sú silne ovplyvnené nasledujúcimi údajmi:
- vyvíjajúce sa predpoklady sekvencií,
- neúplné genomické databázy,
- Pôdne/sondovacie inžinierstvo,
- Tolerancia nekonformity,
- a rozhodnutia o redizajne prebiehajúcej analýzy.
Článok ukázal, že výsledky PCR pri ebole sa menia so zmenami v primeroch a sondách v testoch, že tie isté ľudské vzorky poskytujú nekonzistentné pozitívne a negatívne klasifikácie eboly s rôznymi konfiguráciami testov a že novoobjavená sekvenčná diverzita podkopáva skoršie PCR systémy postavené na neúplných genomických predpokladoch.
Je dôležité, že štúdia nikdy nezávisle nepreukázala, ktorý výsledok testu bol v prípade sporných ľudských vzoriek skutočne správny.
Namiesto toho sa v článku ukázalo, že samotné diagnostické výsledky eboly sa líšili v závislosti od toho, ako bol systém PCR navrhnutý.
- Štúdia tiež uznáva, že údajne „neobjavená“ sekvenčná diverzita môže v budúcnosti naďalej podkopávať súčasné analýzy, rovnako ako novoobjavená sekvenčná diverzita podkopávala tie predchádzajúce.
- To znamená, že systémy RT-PCR pre vírus Ebola zostávajú neustále závislé od neúplných genomických databáz, meniacich sa sekvenčných predikcií, zmien v dizajne primerov/sond, rozhodnutí o tolerancii nesúladu a neustáleho prepracovávania samotného testu.
Ak tie isté ľudské vzorky môžu viesť k nekonzistentným výsledkom testov na ebolu s rôznymi konfiguráciami PCR – bez nezávislého overenia, ktorý výsledok bol skutočne správny – potom je spoľahlivosť testov používaných na počítanie „prípadov“ eboly a na založenie karantén a iných reakcií na ohniská na týchto prípadoch vážne spochybnená.
PCR hantavírusu: Falošne pozitívne výsledky
Podľa novín Jerusalem Post bol v Izraeli potvrdený prvý prípad hantavírusu. Pacientom je muž, ktorý predtým cestoval do východnej Európy. Konkrétna krajina v regióne, ktorú navštívil, nebola zverejnená.
Muž ochorel niekoľko mesiacov po návrate do Izraela. Lekársku pomoc vyhľadal, keď pocítil príznaky typické pre toto ochorenie. Prítomnosť hantavírusu v tele pacienta potvrdil PCR test, uvádza publikácia.
Čo je zas zlé na PCR testoch?
Už sme podstúpili PCR testy na osýpky a na Nipah, ktorý ustúpil pred niekoľkými mesiacmi .
BLAST analýza priameho primeru, reverzného primeru a fluorescenčnej sondy použitej v publikovanom teste RT-qPCR hantavírusu odhalila opakujúce sa presné zhody s ľudským genomickým materiálom, čo vyvoláva otázky, či ľudské nukleové kyseliny môžu prispievať k pozitívnej tvorbe PCR signálov hantavírusu za určitých podmienok testu.
BLAST je skratka pre Basic Local Alignment Search Tool (Nástroj pre základné lokálne zarovnanie vyhľadávania), čo je široko používaný bioinformatický algoritmus na porovnávanie biologických sekvencií.
Jednoducho povedané, časti genetických sekvencií použitých v PCR teste na údajnú detekciu hantavírusu sa tiež priamo zhodujú so sekvenciami ľudskej DNA.
- To znamená, že testované zložky neboli na úrovni sekvencie jedinečné pre hantavírus.
- Pozitívne výsledky môžu naznačovať skôr prítomnosť ľudského materiálu ako vírusového materiálu.
Toto odhalenie prichádza uprostred rozsiahleho mediálneho poplachu ohľadom podozrenia na vypuknutie hantavírusu na výletnej lodi pri pobreží západnej Afriky.
Nové výsledky BLAST sú ešte významnejšie v kombinácii s pôvodným americkým patentom 5 210 015, ktorý výslovne uvádza, že komplementarita PCR sondy „nemusí byť dokonalá“ a že detekovateľný signál môže vzniknúť prostredníctvom „štiepenia nezávislého od polymerizácie“, t. j. detekovateľné generovanie fluorescenčného signálu nemusí nevyhnutne vyžadovať úplnú amplifikáciu cieľa.
Jednoducho povedané, pôvodný patent, ktorý je základom moderného testovania TaqMan PCR, uznáva, že chemický proces môže generovať detekovateľný signál aj pri nedokonalej genetickej zhode a dokonca aj vtedy, keď nedôjde k úplnej amplifikácii cieľovej sekvencie.
Aj čiastočná podobnosť medzi PCR zložkami hantavírusu a ľudskou genetikou môže viesť k pozitívnemu výsledku testu, aj keď vírus nie je prítomný.
Analyzované komponenty zahŕňali:
- Predbežný náter:
GCAGCTGTGTCTACATTGGAGAA - Reverzná kapsula:
TGGTTTTGAAGCCAGTTTTTGA - Poradie sondy:
AAACTCGCAGAACTCAAGAGACAGCTGGC
Boli získané zo štúdie PLoS Neglected Tropical Diseases v decembri 2019.
Priméry sú krátke genetické sekvencie určené na väzbu na cieľovú oblasť a spustenie amplifikácie.
Sonda je fluorescenčná detekčná zložka, ktorá pomáha generovať „pozitívny“ signál viditeľný pre zariadenie.
Sekvencia sondy bola získaná z publikovanej analýzy po odstránení fluorescenčných reportérových a zhášacích značiek ( a ), takže bola analyzovaná iba samotná nukleotidová sekvencia.FAMZEN
Forward Primer poskytoval rozsiahle verejne dostupné zápasy
BLAST analýza priameho primeru priniesla viacero presných a takmer presných zhôd s ľudským genomickým materiálom.
To znamená, že časti sekvencií primerov sa priamo zhodovali so sekvenciami, ktoré sú už prirodzene prítomné v ľudskom genóme.
Výsledky zahrnuté:
- opakovať presné zhody 19/19,
- niekoľko presných zhôd 18/18,
- 17 zo 17 presných zhôd sa opakovalo
- a široká škála zápasov 16 zo 16.
„Presná zhoda 19/19“ znamená, že 19 po sebe idúcich genetických písmen predstavuje dokonalú zhodu medzi požadovanou sekvenciou a ľudskou DNA.
Zhodná postupnosť:
- Regióny spojené s GALNT6
- Regióny spojené s EPHB2
- Regióny spojené so ZBTB20,
- Chromozóm 1,
- Chromozóm 3,
- Oblasti zosilňovačov,
- Knižnice klonov BAC,
- a mnoho ďalších genomických lokusov.
Jedna z trás ukazovala:
Identity: 19/19 (100 %)
Ďalší ukázal:
Identity: 18/18 (100 %)
Zdroj údajov: https://jonfleetwood.substack.com/api/v1/file/ccd1a19f-aecd-4cbc-ae4e-cab60b7720bb.pdf
Reverzný primer sa tiež zhodoval s ľudskou DNA na niekoľkých chromozómoch.
Reverzný primer priniesol podobne široké ľudské zarovnania.
Inými slovami, obe strany PCR amplifikačného systému vykazovali významné prekrývanie sekvencií s ľudským genetickým materiálom.
Výsledky zahrnuté:
- 20/20 presných zhôd sa opakovalo,
- niekoľko presných zhôd 18/18,
- početné presné zhody 17/17,
- a rozšírené zápasy 16/16.
„Zhoda 20/20“ znamená, že všetkých 20 genetických písmen sa dokonale zhoduje s ľudskou DNA.
Zhodná postupnosť:
- RBFOX1,
- KCNH5,
- TGFB2,
- DLG2,
- CDH13,
- ROBO2,
- PLA2G4A,
- MYO5C,
- oblasti ťažkého reťazca imunoglobulínov,
- ako aj početné oblasti ľudských chromozómov vrátane chromozómov 1, 3, 5, 8, 11, 14, 15, 16, 18, 20, 21, X a Y.
Jeden z pokynov ukazoval:
Identity: 20/20 (100 %)
Iní ukázali:
Identity: 18/18 (100 %)
A:
Identity: 17/17 (100 %)
Zdroj: https://jonfleetwood.substack.com/api/v1/file/2b49807e-09d1-4327-9618-2766786bffb9.pdf
Fluorescenčná detektorová sonda vytvorila opakovateľné a presné zhody s ľudskými…
Najodhaľujúcejšie výsledky sa získali z BLAST analýzy samotnej fluorescenčnej sondy TaqMan – sekvencie priamo zapojenej do chémie detekcie signálu.
Toto je dôležité, pretože sonda je zodpovedná za generovanie fluorescenčného signálu, ktorý PCR prístroj interpretuje ako „pozitívny“.
Sonda vyprodukovala:
- 18/18 presných zhôd bolo opakovaných
- početné presné zhody 17/17,
- 16 zo 16 presných zhôd sa opakovalo
- a 20/21 (95 %) sa zhoduje s ľudskou genomickou DNA.
Zhoda 20/21 znamená, že 20 z 21 genetických písmen je rovnakých ako ľudská DNA.
Sonda zarovnaná s:
- Chromozóm 1,
- Chromozóm 12,
- chromozóm 18,
- chromozóm 19,
- 21. chromozóm,
- TMEM192,
- Varianty transkriptu MGA,
- BCLAF3,
- SESN1,
- Oblasti zosilňovača OCT4-NANOG,
- ako aj niekoľko knižníc ľudského genómu BAC a FOSMID.
Jedna z trás ukazovala:
Identity: 18/18 (100 %)
Ďalší ukázal:
Identity: 17/17 (100 %)
A ďalší ukázal:
Identity: 20/21 (95 %)
Zdroj tabuliek: https://jonfleetwood.substack.com/api/v1/file/4992e7b0-5c04-440f-b018-a53899b0a7c8.pdf
Pôvodný patent TaqMan uznáva nedokonalú komplementaritu
Pôvodný patent TaqMan PCR výslovne uvádza:
„Komplementácia nemusí byť dokonalá; stabilné duplexy môžu obsahovať nezodpovedajúce páry báz alebo nezodpovedajúce bázy.“
Patent uznáva, že pozitívna chémia, ktorá prináša pozitívne výsledky, môže fungovať aj pri nedokonalej genetickej zhode.
V patente sa tiež uvádza:
„V tomto procese nie je polymerizácia potrebná na to, aby bola nukleová kyselina polymeráza schopná dosiahnuť štiepenie, preto to nazývame štiepenie nezávislé od polymerizácie.“
To znamená, že detekovateľná signálna chémia môže nastať aj bez úplnej amplifikácie cieľovej sekvencie.
A:
„Týmto spôsobom je možné získať dostatočný počet značených fragmentov, čo umožňuje ich detekciu aj bez polymerizácie.“
To znamená, že patent jasne opisuje situácie, v ktorých môže vzniknúť detekovateľný signál aj bez úplného amplifikačného procesu, ktorý je typicky spojený s PCR.
Patent tiež vysvetľuje:
„Jednou z výhod procesu nezávislého od polymerizácie je, že eliminuje potrebu amplifikácie cieľovej sekvencie.“
Detekované generovanie signálu môže nastať bez úplnej amplifikácie cieľovej genetickej sekvencie.
Výsledok
Výsledky testu BLAST a znenie patentu ukazujú:
- priamy primer sa replikuje presne s ľudskou DNA,
- Reverzný primer sa replikuje presne s ľudskou DNA,
- a samotný fluorescenčný detektor opakuje presné zhody s ľudskou DNA.
Všetky tri hlavné komponenty zapojené do amplifikačného a detekčného systému testu preukázali priame prekrývanie sekvencií s ľudským genetickým materiálom.
Medzitým pôvodný patent TaqMan výslovne uznáva, že:
- Komplementarita „nemusí byť dokonalá“
- Detekovateľný signál môže vzniknúť prostredníctvom „štiepenia nezávislého od polymerizácie“,
- a detekcia môže nastať „bez polymerizácie“.
Výsledky spoločne naznačujú možnosť, že samotný ľudský genetický materiál môže za určitých testovacích podmienok pravdepodobne prispievať k tvorbe pozitívnych PCR signálov hantavírusu.
Ak sa priméry testu a fluorescenčná detekčná sonda významne prekrývajú s ľudským genetickým materiálom, potom takzvané „prípady“ hantavírusu nemusia byť ničím iným ako systémom PCR detegujúcim vlastnú genetiku pacienta, a nie samotným vírusom.
Najnovšie materiály o PCR
- PCR hantavírusu: Falošne pozitívne výsledky
- Osýpky sa zisťujú pomocou PCR: ale čo tento test ukazuje?
- Zisťuje sa NIPAH opäť pomocou PCR?
- Nepresnosť PCR diagnostiky sa po 5 rokoch opäť preukázala.
- Súd rozhodol, že PCR test z nosa je „nezákonnou požiadavkou“.
Zdroje informácií o ebole
- Ebola a ďalšie paralely s programami reakcie USA
- Nové zvláštne „náhody“ medzi vypuknutím eboly a jej injekciou mRNA
- Odborníci v Ženeve pripravovali nové vakcíny pre nové pandémie.
Ďalšie materiály na tému PCR
- Osýpky sa zisťujú pomocou PCR: ale čo tento test ukazuje?
- Zisťuje sa NIPAH opäť pomocou PCR?
- Nepresnosť PCR diagnostiky sa po 5 rokoch opäť preukázala.
- Súd rozhodol, že PCR test z nosa je „nezákonnou požiadavkou“.
Materiály o hantavírusoch
- Hantavírus, génová terapia a rozhovory s WHO
- Bielkoviny červených rias a zníženie záťaže novým „hantavírusom“
Zdroj: Americká armáda potvrdzuje, že PCR testy na ebolu prinášajú nekonzistentné výsledky na rovnakých ľudských vzorkách: Vedecké správy
Zanechajte nám komentár