Kvantitatívna analýza obsahu nukleových kyselín v šaržiach vakcín proti ochoreniu COVID-19 Spikevax (Moderna) a BNT162b2 (Pfizer)

Zodpovedajúci autori :Richard M. Fleming, PhD, MD, JD, Peter Kotlár, MD, MUDr. a PhD. Soňa Peková, Fyzik, nukleárny kardiológ, právnik, Spojené štáty, splnomocnenec Slovensko, Tilia Laboratories – Pchery, Česká republika

Dátum prijatia : 24. apríla 2025 a 5. mája 2025, dátum publikácie : 13. mája 2025

DOI: 10.24966/AVS-7397/100124

Abstrakt

Kontext: Vznik vakcín proti COVID-19 na báze mRNA predstavoval významný pokrok v reakcii verejného zdravotníctva počas pandémie. Vznikli však otázky týkajúce sa konzistentnosti ich obsahu nukleových kyselín, prítomnosti nedeklarovaného genomického materiálu a pokračujúceho používania zastaraných vírusových sekvencií. 

Metódy: V tejto štúdii bolo analyzovaných 17 šarží vakcín Spikevax (Moderna) a 7 šarží vakcín BNT162b2 (Pfizer) na obsah nukleových kyselín pomocou multiplexnej kvantitatívnej real-time PCR. Vzorky boli hodnotené na identitu mRNA, množstvo, homogenitu a prítomnosť nedeklarovaných nukleových kyselín vrátane prvkov DNA. Skúmala sa aj stabilita obsahu nukleových kyselín v expirovaných šaržiach vakcín skladovaných pri teplote -80 °C. 

Výsledky: Kvantitatívna analýza potvrdila prítomnosť mRNA sekvencií konzistentných s vakcínami Spikevax a BNT162b2. V jednotlivých šaržiach sa však pozorovali rozdiely v množstve nukleových kyselín. V niektorých vzorkách boli detegované sekvencie DNA vrátane genómových fragmentov Escherichia coli. Napriek vývoju cirkulujúcich variantov SARS-CoV-2 si oba typy vakcín zachovali pôvodnú sekvenciu proteínu S „Wuhan“. Vzorky vakcín po expirácii vykazovali zníženú integritu nukleových kyselín. Nebol identifikovaný žiadny dôkaz o SV40.

Závery: Prítomnosť nedeklarovaných sekvencií DNA a variabilita v obsahu nukleových kyselín v rôznych šaržiach zdôrazňuje potrebu zvýšenej kontroly kvality pri výrobe vakcín. Táto prítomnosť tiež vyvoláva obavy týkajúce sa inflamotrombotickej imunologickej odpovede (ITIR). Regulačný dohľad by sa mal zaoberať potenciálnymi rizikami spojenými s nekonzistentnosťou genetického materiálu, aby sa zabezpečila bezpečnosť a účinnosť vakcíny.

Úvod

Infekčné procesy vrátane procesov spôsobených koronavírusom číslo 2 (SARS-CoV-2) so závažným akútnym respiračným syndrómom vedú k zápalovo-trombotickej imunologickej odpovedi (ITIR) (ITIRD) [1,2], v tomto prípade k koronavírusovému ochoreniu prvýkrát opísanému v roku 2019 (COVID-19). Hoci je medikamentózna liečba možná [3], posilnenie imunity je možné dosiahnuť podávaním vakcín [4,5]. 

Vývoj vakcín proti COVID-19 na báze mRNA, ako sú Spikevax (Moderna) a BNT162b2 (Pfizer), zohral kľúčovú úlohu pri zmierňovaní globálnej pandémie. Tieto vakcíny sa spoliehajú na modifikované molekuly mediátorovej RNA (mRNA), ktoré inštruujú bunky k produkcii spike (S) proteínu SARS-CoV-2, čím spúšťajú imunitnú odpoveď. 

Hoci mRNA vakcíny prešli prísnym klinickým hodnotením, vznikajúce obavy viedli k ďalšiemu skúmaniu ich obsahu nukleových kyselín a konzistencie šarží. Najmä nezrovnalosti v genomickom materiáli vrátane prítomnosti nedeklarovaných sekvencií DNA vyvolali otázky o integrite výroby a potenciálnych biologických rizikách. 

Táto štúdia bola vykonaná na základe formálnej žiadosti splnomocnenca vlády Slovenskej republiky MUDr. Petra Kotlára o posúdenie obsahu nukleových kyselín vo viacerých šaržiach vakcín Spikevax a BNT162b2. Cieľom analýzy bolo: 

• Identifikujte nukleové kyseliny prítomné vo vakcínových prípravkoch.
• Kvantifikujte obsah nukleových kyselín vo viacerých šaržiach.
• Vyhodnoťte homogenitu dávky.
• Zistite, či bol prítomný nedeklarovaný genetický materiál.
• Posúďte potenciálne biologické dôsledky neočakávaných nukleových kyselín.
• Preskúmajte vplyv podmienok skladovania po uplynutí doby použiteľnosti na stabilitu nukleových kyselín.
• Zistenia poskytujú prehľad o zložení, stabilite a výrobných postupoch vakcín s dôsledkami pre politiku verejného zdravia a regulačný dohľad.

Metódy

Terminológia 

Vzhľadom na relatívne raný vývoj tejto oblasti genetických vakcín uvádzame nasledujúcu terminológiu. 

mRNA – mediátorová RNA; nukleová kyselina na prenos genetickej informácie v nej obsiahnutej do proteínu transláciou, DNA – deoxyribonukleová kyselina, v tomto projekte používaná v zmysle dvojvláknovej DNA (dsDNA), Multiplexná kvantitatívna real-time PCR – PCR v reálnom čase, umožňujúca kvantitatívnu simultánnu detekciu viacerých molekulárnych cieľov súčasne, Expresný klonovací vektor – kruhová dvojvláknová molekula DNA, ktorá sa používa na subklonovanie, propagáciu a expresiu transgénu, Transgén – cudzí, často umelo vytvorený, syntetický konštrukt nukleovej kyseliny (typicky DNA) určený na účely genetickej modifikácie recipientnej bunky alebo organizmu. 

GMO – geneticky modifikovaný organizmus a S proteín – jeden z proteínov SARS-CoV-2, ktoré tvoria vírusový hrot, ktorý sa pripája k povrchu buniek, pričom genetická sekvencia sa medzi jednotlivými variantnými kmeňmi vírusu líši. 

Odber a manipulácia so vzorkami 

Dvadsaťštyri rôznych šarží vakcín (17 Spikevax, 7 BNT162b2) bolo dodaných za kontrolovaných podmienok. Každá šarža obsahovala 10 originálnych, neotvorených injekčných liekoviek skladovaných pri teplote -80 °C. Prepravné podmienky boli overené pomocou zabudovaného teplomeru, aby sa zabezpečila nepretržitá kontrola teploty.

Balenie obsahovalo nasledujúce várky 

Spikevax (Moderna): MV1013A, 200023A, 200156A, 223049, 200090A, 200106A, 200100A,

3005885, 3005836, 000090A, 000058A, 3005241, 3005697, 3006272, MV1018A, 400012A,

400011A. 

BNT162b2 (Pfizer): FP9632, 1F1051A, 1LO84A, 1F1047A, 1F1059A, 1F1055A, PCB0020. 

Izolácia nukleových kyselín 

Vzorky boli rýchlo rozmrazené a spracované pomocou súpravy QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Nemecko) podľa protokolu výrobcu. DNA a RNA boli eluované v 50 µl elučného pufra. Reverzná transkripcia bola vykonaná pomocou súpravy verso cDNA Kit (ThermoFisher Scientific, USA) pri teplote 47 °C počas 1 hodiny. Všetky izoláty boli následne skladované pri teplote -80 °C. 

Použitý analytický postup 

Z každej testovanej šarže (obsahujúcej 10 jednotlivých liekoviek v označených škatuľkách) sa použilo 5 originálnych, neotvorených, nepoužitých liekoviek s produktom. Zostávajúce nepoužité liekovky sa ponechali neporušené ako referenčný materiál pri teplote -80 °C. Zvyšky po odobratí príslušného objemu na analýzu (pozri nižšie) sa zaistili parafilmom a vrátili sa pri teplote -80 °C na ďalšie porovnanie. 

Izolácia DNA a RNA 

Izolácia DNA a RNA sa uskutočnila pomocou komerčnej izolačnej súpravy QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Nemecko) podľa pokynov výrobcu. Fľaštičky s jednotlivými šaržami určenými na spracovanie sa vybrali z teploty -80 °C a rýchlo sa rozmrazili v prúde vzduchu pri izbovej teplote. 500 μl každej vzorky sa pipetou prenieslo do vopred pripravených skúmaviek s proteinázou K a lyzačným pufrom. Po 10 minútach inkubácie pri 60 °C sa lyzát precipitoval etanolom s teplotou 96 °C a centrifugoval sa cez izolačné kolóny. Izolačné kolóny sa potom premyli puframi s rôznym obsahom etanolu a filtre sa vysušili na vzduchu. DNA a RNA sa eluovali do 50 μl elučného pufra. 

Na reverznú transkripciu sa použili 4 μl izolátu DNA/RNA s použitím súpravy verso cDNA (ThermoFisher Scientific, USA) podľa pokynov výrobcu. Reverzná transkripcia sa uskutočnila pri teplote 47 °C počas 1 hodiny. 

Izoláty DNA/RNA boli skladované pri teplote -80 °C, cDNA pri teplote -20 °C. 

PCR analýza

Multiplexná kvantitatívna real-time PCR bola vykonaná s použitím oligonukleotidov špecifických pre:

• mRNA pre S proteín (molekulárny cieľ deklarovaný výrobcom)
• Sekvencia DNA Ori (obsiahnutá v expresných klonovacích vektoroch)
• DNA ITS Escherichia coli (na detekciu možnej kontaminácie bakteriálnou DNA použitou pri vektorovom rozmnožovaní)

Molekulárne ciele pre kvantitatívnu multiplexnú real-time PCR 

Nasledujúce výrobcom deklarované a výrobcom nedeklarované molekulárne ciele boli

používa sa na analýzu obsahu jednotlivých šarží na úrovni nukleových kyselín: 

• mRNA pre S proteín, výrobcom deklarovaný molekulárny cieľ; sekvencia v Spikevax GenBank: OK120841; sekvencia v BNT162b2 GenBank: OR134577 
• DNA Ori obsiahnutá v expresnom klonovacom vektore, GenBank: OR134577 
• DNA ITS Escherichia coli – interný transkribovaný medzerník v 16S rDNA kazete, 

GenBank: AP027563, na posúdenie úrovne možnej kontaminácie vzoriek genomickou DNA Escherichia coli použitou na rozmnožovanie expresných vektorov počas výrobných procesov. 

Genomické referenčné sekvencie boli získané z GenBank, vrátane 

• Pôvodná referenčná sekvencia kmeňa Wuhan SARS-CoV-2 (GenBank: MT192773) [6]
• Sekvencia mRNA vakcíny Spikevax (GenBank: OK120841) [7]
• Sekvencia mRNA BNT162b2 (GenBank: OR134577) [8]

Výsledky

Identifikácia nukleových kyselín 

PCR analýza potvrdila prítomnosť mRNA sekvencií zodpovedajúcich deklarovaným profilom vakcín Spikevax a BNT162b2. Zarovnanie sekvencií preukázalo významné rozdiely medzi mRNA sekvenciami vakcíny a pôvodnou mRNA proteínu spike (S) vírusu SARS-CoV-2 z Wuhanu (GenBank: MT192773). Tieto rozdiely odrážajú zámerné modifikácie vykonané na zvýšenie stability mRNA a účinnosti translácie.

Napriek týmto geneticky modifikovaným rozdielom obsahoval kódovaný S proteín v oboch vakcínach iba dve aminokyselinové substitúcie (K986P a V987P) v porovnaní s kmeňom Wuhan. Táto stabilizačná stratégia je v súlade s dokumentáciou výrobcu. 

Oligonukleotidy pre kvantitatívnu multiplexnú real-time PCR 

Sekvencie mRNA vakcín Spikevax a BNT162b2 sa nielen významne líšia od seba navzájom, ale aj od pôvodnej sekvencie mRNA SARS-CoV-2 pôvodného cirkulujúceho kmeňa.

„Wu-chan“ (GenBank MT192773). 

Tieto rozdiely sa použili na rozlíšenie mRNA z rôznych zdrojov. mRNA môžu mať rôzne sekvencie a stále kódujú rovnaký proteín – kodóny (triplety kódujúce aminokyseliny) sa môžu pre jednotlivé aminokyseliny líšiť; aspoň na ich tretej pozícii; heterogenita kodónových sekvencií pre aminokyseliny je vysoká. 

Na úrovni proteínov je S proteín vo vakcínach Spikevax (Moderna) aj BNT162b2 (Pfizer) takmer identický a líši sa od S proteínu pôvodného kmeňa SARS-CoV-2 „Wuhan“, ktorý cirkuloval v marci 2020, iba dvoma aminokyselinovými substitúciami, K986P (Lys986Pro) a V987P (Val987Pro). Výsledky sú znázornené na obrázkoch 1-5 . 

Na základe bioinformatickej analýzy bola v sekvencii mRNA vakcín Spikevax a BNT162b2 identifikovaná oblasť, ktorá bola dostatočne homológna na to, aby bolo možné navrhnúť priméry na amplifikáciu mRNA S proteínov vakcín Spikevax aj BNT162b2, a zároveň dostatočne heterológna na to, aby fluorescenčne značené hybridizačné sondy mohli presne rozlíšiť mRNA S proteínov vakcín Spikevax a BNT162b2 pomocou kvantitatívnej real-time PCR. Vybraná oblasť je znázornená na obrázku 6.

Obrázok 6: Oblasť blízko 3′ konca mRNA S proteínu sekvencií Spikevax (Query) a BNT162b2 (Subject), na ktoré sa zameriava kvantitatívna Real-Time PCR. Spoločný priamy primer (červená), spoločný reverzný primer (modrá), oblasť rozlišujúca sondu (BNT162b2 zelenou farbou – FAM, Spikevax oranžovou farbou – ROX).

Priméry a fluorescenčne značená sonda na kvantitatívnu detekciu genomickej DNA Escherichia coli (HEX) pomocou PCR v reálnom čase boli navrhnuté pre internú transkribovanú medzerovú oblasť (ITS) kazety 16S rDNA. Test bol validovaný podľa normy ISO 13485 a v laboratóriu sa bežne diagnosticky používa. 

Všetky použité priméry a fluorescenčne značené hybridizačné sondy boli syntetizované na mieru spoločnosťou Eurofins Genomics, Nemecko.

Sekvencie primerov a fluorescenčne značených hybridizačných sond použitých v multiplexnej kvantitatívnej real-time PCR mRNA a expresných kaziet pre S proteín Spikevax, BNT162b2, expresný klonovací vektor a genómovú DNA Escherichia coli sú uvedené v tabuľke 1.

Oligonukleotid	Poradie v 5′-3′
Pfi_Mo bežné F	TGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAG
Pfi_Mo bežný R	GGTGTTGTCGGTGGTGATGATCTGG
VV_Ori_F	CTACATACCTCGCTCTGCTAATC
VV_Ori_R	GCGCCTTATCCGGTAACTATC
EcoliITS-F03	CACTCAGGCCTACCAAATTTGCA
EcoliITS-R02	TCGCAGTGAACCTTTGCAGGTAC
EcoliITSPore_15	HEX – CGCATAGCTCCACCATCTCTGTAGTG – BHQ1
Sonda Spikevax	ROX – TCCCCAGAGCGCACCCACGGAGTGGTT – BHQ2
VV_Ori_Probe	CY5 – TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTT – BHQ2
Sonda BNT162b2	FAM – CCCTCAGTCTGCCCTCACGGCGTGGTGTT – BHQ1

Tabuľka 1: Prime a fluorescenčné značenie. 

Priméry a fluorescenčne značená sonda (Cy5) pre kvantitatívnu real-time PCR vektora klonujúcej expresiu sa mapujú na oblasť promótora Ori bivalentného expresného vektora Pfizer BNT162b2 (GenBank OR134577) a ich sekvencie sú publikované inde.

Návrh a validácia kvantitatívnej multiplexnej real-time PCR

Keďže deklarovaná mRNA v Spikevaxe aj BNT162b2 je modifikovaná pseudouridínom a nie je známe, do akej miery túto modifikáciu vykonal výrobca, nebolo možné ju umelo syntetizovať, ako je bežnou praxou pri konštrukcii kalibračných kriviek na základe presnej znalosti sekvencie, dĺžky sekvencie a hmotnosti syntetizovanej cieľovej sekvencie. 

Preto sme použili alternatívnu metódu, kde boli cDNA Spikevax a cDNA BNT162b2 zriedené v sériových logaritmických riedeniach, aby sme posúdili, či rozdiel v amplifikačných krivkách pre daný test zodpovedá rozdielu približne 3 cyklov (Ct), čo je parameter správne navrhnutého testu a optimálnej reakčnej účinnosti všetkých reakčných zložiek. Ak je nameraný rozdiel v hodnotách Ct v jednotlivých logaritmických riedeniach približne 3 cykly, i) výsledky merania možno považovať za platné a ii) je možné použiť univerzálnu kalibračnú krivku, ktorú rutinne používame na podobné účely v prípadoch, keď je potrebná kvantifikácia neznámeho cieľa. 

Univerzálna kalibračná krivka bola vytvorená spriemerovaním kalibračných kriviek zostrojených pomocou sériových riedení syntetických, presne definovaných genomických fragmentov 50 mikroorganizmov, vrátane ssRNA vírusov, dsRNA vírusov, ssDNA vírusov, dsDNA vírusov, baktérií a húb (molekulárne ciele, ktoré laboratórium rutinne diagnosticky skúma pomocou kvantitatívnej Real-Time PCR). 

Univerzálna rovnica kalibračnej krivky, ktorú sme použili v tomto výskume, bola 

[Rovnica 1] konc = 10^(-0,257*Ct+11,897). 

Pomocou tejto rovnice sme vypočítali počet kópií cieľovej sekvencie v danom objeme s použitím získaných hodnôt Ct pre každý jednotlivý amplikón. 

Kvantitatívna real-time PCR sa uskutočnila s použitím FastStart™ Taq DNA polymerázy, Roche, USA, s konečnou koncentráciou 2 mM MgCl2. Nukleotidy boli zakúpené od spoločnosti Sigma, Nemecko. 

Teplotný profil pre amplifikáciu všetkých molekulárnych cieľov v kvantitatívnej multiplexnej Real Time PCR bol nasledovný: 94 °C 5 min počiatočná denaturácia, potom 50 cyklov: 94 °C počas 20 sekúnd, 57 °C počas 30 sekúnd, potom 72 °C počas 30 sekúnd. 

Tieto výsledky pre spoločnosti Moderna a Pfizer sú zobrazené na obrázkoch 7 a 8. 

Obrázok 7: Experiment s riedením cDNA so Spikevaxom – koncentrovaná cDNA a 4 sériové logaritmické riedenia. 

Obrázok 8: Experiment s riedením cDNA BNT162b2 – koncentrovaná cDNA a 4 sériové logaritmické riedenia.

Prítomnosť nedeklarovaných sekvencií DNA

Počas tejto počiatočnej validácie sa zistilo, že izoláty cDNA boli silne kontaminované expresným klonovacím vektorom. 

Tieto neočakávané sekvencie DNA boli identifikované v niekoľkých šaržiach vakcín. Analýza potvrdila prítomnosť fragmentov bakteriálnej genómovej DNA z Escherichia coli, konkrétne sekvencií z oblasti interného transkribovaného spaceru (ITS) 16S rDNA. Tieto elementy DNA sú spojené s bakteriálnymi vektormi používanými počas výroby mRNA. 

Pre úplnosť sme vykonali sériové logaritmické riediace krivky DNA kontaminujúceho expresného vektora, ktoré boli merané pomocou použitého kvantitatívneho multiplexného Real-Time PCR testu, v podstate ako náhodný nález na pozadí primárneho cieľa – validovať reakčnú účinnosť detekcie výrobcom deklarovaného cieľa, teda mRNA pre S proteín. 

Tieto DNA amplikóny tiež vykazovali prijateľnú reakčnú účinnosť na základe nameraných hodnôt Ct v experimente s riedením, ako je znázornené na obrázkoch 9 a 10. 

Obrázok 9: Experiment s riedením cDNA vakcíny Spikevax – koncentrovaná cDNA a 4 sériové logaritmické riedenia. Náhodná koamplifikácia kontaminujúcej genomickej DNA expresného vektora.

Obrázok 10: Experiment s riedením cDNA BNT162b2 – koncentrovaná cDNA a 4 sériové logaritmické riedenia. Náhodná koamplifikácia kontaminujúcej genomickej DNA expresného vektora.

Oligonukleotidy pre kvantitatívnu real-time PCR klonovania expresie promótora Ori Sekvenovanie bivalentných mRNA vakcín Moderna a Pfizer preukázalo nanogramové až mikrogramové množstvá expresného vektora dsDNA na dávku. Nebol identifikovaný žiadny dôkaz SV40. 

Oligonukleotidy pre kvantitatívnu real-time PCR genomickej DNA Escherichia coli boli validované na základe požiadaviek normy ISO 13 485 ako zložka komerčnej diagnostickej súpravy. 

Oligonukleotidy pre kvantitatívne kazety Real-Time PCR pre S proteín (mRNA) v preparátoch Spikevax a BNT162b2, novo použité v tejto práci, boli overené priamym sekvenovaním získaných PCR produktov na kapilárnom sekvenátore ABI 3500 (ThermoFisher Scientific, USA). 

Všetkých 17 šarží vakcíny Spikevax a všetkých 7 šarží vakcíny BNT162b2 bolo sekvenovaných. Priame sekvenovanie PCR produktov sa uskutočnilo pomocou súpravy BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ThermoFisher Scientific, USA). Sekvenačné reakcie boli purifikované pomocou súpravy BigDye XTerminator™ Purification Kit (ThermoFisher Scientific, USA) podľa postupu odporúčaného výrobcom. 

Jeden typický príklad fragmentu chromatogramu génu proteínu S vakcíny Spikevax a jeden typický príklad fragmentu chromatogramu génu proteínu S BNT162b2 sú znázornené na obrázku 11. Údaje zo sekvenovania ABI 3500 všetkých ostatných šarží sú k dispozícii na požiadanie.   

Obrázok 11 : Sangerove sekvenčné chromatogramy získaných PCR produktov. Vo všetkých prípadoch sekvenované PCR produkty vykazovali 100 % identitu s očakávanou referenčnou sekvenciou. A 1_Moderna_S_proteín_MV1013A_DNA; B – 86_Pfizer_S proteín_FP9632_DNA.

Kvantitatívna real-time PCR analýza mRNA pre S proteín

Na úrovni mRNA (cDNA) sa zistilo, že expresia deklarovaného molekulárneho cieľa (mRNA S proteínu) sa medzi šaržami líši pre Spikevax aj BNT162b2. 

V prípade vakcíny Spikevax (Moderna), ako je znázornené na obrázku 12, sa šarže 200106A a MV1018A vyznačujú o rád (10x) nižšou expresiou mRNA S proteínu ako ostatné testované šarže. Modré bodky v grafe označujú hodnoty expresie mRNA S proteínu pre jednotlivé merania (v rozsahu 10e9 až 10e10 kópií cieľovej sekvencie/ml; analýza vykonaná v päťnásobnom množstve pre každú šaržu). Oranžové bodky v tomto prípade označujú množstvo expresného klonovacieho vektora DNA (v rozsahu 10e7 až 10e8 kópií cieľovej sekvencie/ml; analýza vykonaná v päťnásobnom množstve pre každú šaržu) prítomného v analyzovaných cDNA. Podobné zistenia sú znázornené na obrázku 13, šarže 1L084A a 1F1059A pre Pfizer BNT162b2. 

Obrázok 12: Graf znázorňuje hladinu expresie mRNA pre S proteín vo vakcíne Spikevax (Moderna), GenBank OK120841 – modré bodky v päťnásobnom opakovaní pre každú testovanú šaržu. Oranžové bodky slúžia ako referencia; ide o prímes dvojvláknovej DNA expresného klonovacieho vektora v testovaných cDNA. 

Obrázok 13: V BNT162b2 (Pfizer) je badateľná aj variácia v expresii mRNA pre deklarovaný S proteín (GenBank OR134577) medzi jednotlivými šaržami – rozdiel rádu (10x) je zrejmý pre šarže 1L084A a 1F1059A – expresia mRNA pre S proteín je v grafe znázornená modrými bodkami. Oranžové bodky slúžia ako referencia; ide o prímes dvojvláknovej DNA expresného klonovacieho vektora v testovaných cDNA. Analýza všetkých šarží sa uskutočnila v päťnásobných vzorkách.

Kvantitatívna analýza cieľov DNA pomocou PCR v reálnom čase – kazety S proteínu a promótora expresného klonovacieho vektora 

Významným zistením je vysoké množstvo DNA prítomnej vo všetkých testovaných šaržiach, a to ako v prípade Spikevaxu (Moderna), tak aj v prípade BNT162b2 (Pfizer). Vo všetkých prípravkoch bol nameraný veľmi vysoký signál Real Time PCR z promótora klonovacieho expresného vektora a z 3′ konca kazety kódujúcej S proteín (10e7 – 10e9 kópií/ml pre Spikevax; 10e8 – 10e9 kópií/ml pre BNT162b2). Analýza všetkých šarží sa uskutočnila v päťnásobných vzorkách, pričom konečné výsledky sú zobrazené na obrázkoch 14 a 15. 

Obrázok 14. Zobrazuje vysoké množstvo DNA pre expresný klonovací vektor aj DNA pre kazetu S proteínu. Za zmienku stoja šarže 200023A, 200106A, MV1018A, kde sú pomery vektora a kazety obrátené. Je tiež zaujímavé, že šarže 3005697 a 400012A sú kvantitatívne významne mimo rozsahu ostatných testovaných šarží.

Obrázok 15: Znázorňuje podobnú situáciu pre prípravky BNT162b2 (Pfizer). V týchto prípravkoch je množstvo expresného klonovacieho vektora vyššie, ale dôležitejšia je horizontálna heterogenita v rámci modrých bodiek, ktoré predstavujú kvantitatívne amplikóny kazety DNA S proteínu. Všimnite si rozdiel medzi šaržami o rád (10x). 

Tieto údaje naznačujú, že oba testy by mohli detegovať identickú konštrukciu DNA, zameranú na jej 5′ koniec (promótor Ori) aj na jej 3′ koniec (bázy 3184 až 3417 z celkových 3880 bp kompletnej kódujúcej sekvencie pre S proteín). To s najväčšou pravdepodobnosťou naznačuje, že Spikevax aj BNT162b2 by mohli obsahovať kompletnú kódujúcu sekvenciu DNA pre kazetu S proteínu spolu s niektorými regulačnými promótorovými sekvenciami. 

Výsledky ukazujú viac než len degradovanú alebo fragmentovanú DNA, ktorá môže vzniknúť v dôsledku nestability skladovaných prípravkov alebo počas suboptimálneho výrobného procesu. Kombinovaný signál s najväčšou pravdepodobnosťou pochádza z konštruktu DNA v plnej dĺžke, ktorý by mohol byť schopný kódovať mRNA pre proteín S v plnej dĺžke. 

V rámci testovaných šarží vakcíny Spikevax (Moderna) je heterogenita v množstve DNA kódujúcej kazetu S proteínu a/alebo klonovací expresný vektor pozoruhodná. V troch prípadoch je pomer množstva expresného klonovacieho vektora a kazety DNA pre S proteín obrátený a rozdiel v množstve je rádovo vysoký. To naznačuje, že daná šarža môže obsahovať aj iný konštrukt klonovaný v danom expresnom vektore. Je možné, že by mohol predstavovať prímes Omicronu, hoci to môže znamenať, že jeho množstvo je v jednotlivých šaržiach veľmi náhodné, čo by vyvolalo obavy týkajúce sa správnej výrobnej praxe. 

V tomto výskume sme nehľadali sekvenciu Omicron. Zamerali sme sa skôr na sekvencie, ktoré sú jasne deklarované ako oficiálne uvedené v prípravkoch – preto sme sa zamerali na mRNA S proteínu [6], GenBank OK120841 (Spikevax, Moderna) [7]; GenBank OR134577 (BNT162b2, Pfizer) [8]. 

Tieto rozdiely v množstve DNA amplikónov sú jasne viditeľné už v surových dátach z analyzátora (RotorGene Q, Qiagen, Nemecko). Všimnite si výrazne odlišné začiatky amplifikačných kriviek. 

Obrázok 16 zobrazuje nespracované údaje analyzované na úrovni DNA pre kazetu S proteínu Spikevax a BNT162b2, ako aj pre expresný klonovací vektor, ktorý je rovnako ako kazeta DNA pre S proteín prítomný vo všetkých testovaných šaržiach. 

 Obrázok 16: Nasledujúce grafické snímky obrazovky zobrazujú nespracované údaje pre DNA kazetu pre S proteín (Spikevax – ROX, BNT162b2 – FAM, expresný klonovací vektor – Cy5). 

Súhrnné výsledky množstiev mRNA a DNA pre kazetu S proteínu sú uvedené v tabuľke 2 .

Tabuľka 2: Súhrnné množstvá mRNA a DNA vo fľaštičkách Moderna a Pfizer.

Kvantitatívna detekcia genomickej DNA Escherichia coli

Prítomnosť genomickej DNA Escherichia coli bola tiež analyzovaná v rámci multiplexnej kvantitatívnej real-time PCR, aby sa overilo, či boli preparáty kontaminované GMO, ktoré sa typicky používajú na množenie klonovacieho expresného vektora obsahujúceho kazetu S proteínu. 

V dvoch šaržiach BNT162b2 (Pfizer), konkrétne FP9632 a 1F1047A, sa zistilo hraničné množstvo v jednotlivých kópiách mikroorganizmu/ml vzorky. 

Údaje nie sú zobrazené, hoci ich možno poskytnúť na požiadanie.

Posúdenie homogenity 

Hoci medzi šaržami bola 28 % variabilita v obsahu nukleových kyselín, nepozorovali sa žiadne významné nezrovnalosti v rámci šarže. Každá sada liekoviek v rámci danej šarže vykazovala konzistentné profily mRNA a DNA. 

Vplyv uplynutých skladovacích podmienok 

Analýza exspirovaných vzoriek vakcín skladovaných pri teplote -80 °C ukázala čiastočnú degradáciu obsahu nukleových kyselín. Zatiaľ čo fragmenty mRNA zostali detekovateľné, ich integrita bola znížená, čo potenciálne ohrozilo účinnosť vakcíny.

Diskusia

Táto výskumná štúdia vykonala molekulárnu analýzu nasledujúcich šarží genetických vakcín proti COVID od spoločností Moderna a Pfizer: 

Spikevax (Moderna): MV1013A, 200023A, 200156A, 223049, 200090A, 200106A, 200100A, 3005885, 3005836, 000090A, 000058A, 3005241, 3005697, 3006272, MV1018A, 400012A, 400011A a 

BNT162b2 (Pfizer): FP9632, 1F1051A, 1LO84A, 1F1047A, 1F1059A, 1F1055A, PCB0020. 

Analýza vzoriek pomocou kvantitatívnej multiplexnej PCR v reálnom čase odhalila: 

• Interindividuálna heterogenita medzi jednotlivými šaržami je pozoruhodná, s rozdielom v množstve deklarovanej mRNA až 10-násobne.
• Všetky testované šarže vakcín Spikevax (Moderna) a BNT162b2 (Pfizer) obsahujú významnú zmes DNA, ktorá s najväčšou pravdepodobnosťou predstavuje kompletnú kazetu pre S proteín klonovanú v expresnom vektore nesúcom intaktné regulačné sekvencie. Preto nemožno vylúčiť expresiu mRNA pre S proteín v plnej dĺžke z tejto DNA kazety.
• Množstvo DNA namerané pomocou PCR v reálnom čase vo všetkých preparátoch je porovnateľné s množstvom jedinej oficiálne deklarovanej položky, ktorou je mRNA pre proteín S. To naznačuje, že nejde o „kontamináciu“ DNA, ale skôr o bežnú prímes, ktorú ani jeden z výrobcov nedeklaroval.
• Na základe merania množstva prítomnej DNA pomocou PCR v reálnom čase možno pozorovať ďalší stupeň heterogenity medzi jednotlivými šaržami, pričom existuje možnosť, že v niektorých šaržiach by mohli byť prítomné aj iné DNA konštrukty, ktorých identita je v súčasnosti neznáma. 

Prítomnosť sekvencií DNA Escherichia coli vyvoláva otázky týkajúce sa kontroly kvality výroby. Hoci zvyšková DNA z bakteriálnych rozmnožovacích systémov nie je v produktoch rekombinantnej DNA nezvyčajná, jej detekcia v týchto vakcínach naznačuje neúplnú purifikáciu počas výroby. Regulačné normy, ako napríklad tie, ktoré stanovila Európska agentúra pre lieky (EMA) a Úrad pre kontrolu potravín a liečiv (FDA), stanovujú limity pre povolenú zvyškovú DNA [4,5]. Pozorovaný obsah DNA môže tieto limity prekročiť a predstavovať teoretické riziká súvisiace s genomickou integráciou alebo imunologickými odpoveďami. 

Okrem toho pozorovaná variabilita v obsahu mRNA môže ovplyvniť konzistentnosť dávky. mRNA vakcíny sa spoliehajú na presné dodávanie nukleových kyselín, aby sa zabezpečila účinná expresia antigénu. Odchýlky 20 – 30 % medzi šaržami, ako sa pozorovalo v tejto štúdii, môžu viesť k nekonzistentným imunitným odpovediam a zmeneným klinickým výsledkom. 

Pokračujúce používanie sekvencie S proteínu kmeňa Wuhan v oboch vakcínach zdôrazňuje značné obavy. Od začiatku roka 2020 dominovali v obehu vírusu varianty SARS-CoV-2 s výrazne zmenenými štruktúrami spike proteínu. Použitie zastaranej sekvencie môže znížiť ochrannú účinnosť vakcín, najmä proti novším variantom s výrazným antigénnym driftom. 

Zistenia týkajúce sa degradácie mRNA vo vzorkách po exspirácii zdôrazňujú dôležitosť prísneho dodržiavania skladovacích protokolov. Aj pri ultrachladných skladovacích podmienkach viedlo dlhodobé skladovanie po stanovených dátumoch exspirácie k čiastočnej degradácii mRNA, čo potenciálne zhoršilo účinnosť vakcíny. 

Vyššie uvedené údaje ukazujú vysoký stupeň heterogenity medzi jednotlivými prípravkami Spikevax (Moderna) a BNT162b2 (Pfizer), meraný množstvom deklarovanej mRNA pre S proteín. Jednotlivé šarže sa líšia v množstve cieľovej sekvencie mRNA o 1 rád (10x).

Vo všetkých testovaných prípravkoch bolo identifikované vysoké množstvo dvojvláknovej DNA (klonovací expresný vektor, DNA kazeta pre S proteín). Je zaujímavé, že množstvo DNA bolo porovnateľné s množstvom mRNA deklarovaným výrobcom. 

Takéto vysoké množstvo DNA jednoznačne nemožno považovať za obyčajnú „kontamináciu“ počas výrobného procesu. V prípade „kontaminácie“ by sa očakávalo, že množstvo kontaminujúcej DNA bude o mnoho rádov nižšie, v rozmedzí približne 10e2 alebo 10e3 kópií/ml. Náhodnú „kontamináciu“ prípravkov Spikevax a BNT162b2 dvojvláknovou DNA počas výrobného procesu možno preto vylúčiť. 

Okrem toho sa v dvoch prípadoch prípravku BNT162b2 (Pfizer) zistila nevýrazná, hraničná kontaminácia genomickou DNA Escherichia coli (GMO používaná na veľkovýrobu klonovacích vektorov) v jednotlivých jednotkách kópií cieľového mikroorganizmu/ml. V porovnaní s veľkým množstvom DNA klonovacieho vektora a S-kazety zistenej vo všetkých testovaných šaržiach by sa to dalo považovať za zanedbateľný nález. SV40 nebol identifikovaný. 

Prítomnosť takého vysokého množstva DNA vo všetkých testovaných šaržiach naznačuje, že nemusí byť výsledkom nejakej kontaminácie počas nedostatočného výrobného procesu, ale skôr by sa mohla považovať za pravidelnú (hoci nie oficiálne deklarovanú) zložku všetkých testovaných šarží, prítomnú v množstvách (takmer) identických s množstvom mRNA pre S proteín. 

Spoločnosti Pfizer aj Moderna identifikovali jediné oligonukleotidové materiály vo svojich vakcínach ako mRNA. Prítomnosť dvojvláknovej DNA alebo akejkoľvek inej DNA v prípravkoch Moderna a Pfizer nebola ani jedným z výrobcov deklarovaná.

Záver

Táto štúdia zdôrazňuje kľúčové zistenia týkajúce sa obsahu oligonukleotidov vo vakcínach Spikevax (Moderna) a BNT162b2 (Pfizer) proti COVID-19. Prítomnosť týchto genetických sekvencií tiež vyvoláva obavy týkajúce sa zápalovo-trombotickej imunologickej odpovede (ITIR) [1]. Hoci deklarované sekvencie mRNA boli potvrdené, variabilita v obsahu nukleových kyselín a prítomnosť nedeklarovaných sekvencií DNA zdôrazňujú potrebu zlepšenej kontroly kvality pri výrobe vakcín. 

Medzi kľúčové odporúčania patria: 

• Protokoly vylepšenej purifikácie: Výrobcovia by mali prehodnotiť procesy odstraňovania DNA, aby minimalizovali zvyškovú kontamináciu a znížili zápalovo-trombotickú imunologickú odpoveď (ITIR).
• Prísnejšie testovanie šarží: Odporúča sa dodatočný dohľad, aby sa zabezpečila konzistentnosť obsahu nukleových kyselín medzi jednotlivými šaržami.
• Genomické aktualizácie: Vzhľadom na prebiehajúci vývoj variantov SARS-CoV-2 by sa návrhy vakcín mali zhodovať so súčasnými cirkulujúcimi kmeňmi.
• Stiahnutie kontaminovaných genetických vakcín z trhu.
• Prísnejší dohľad zo strany regulačných agentúr vrátane FDA, EMA a ŠÚKL. 

Neustála ostražitosť pri výrobe vakcín a regulačný dohľad sú kľúčové pre zabezpečenie dôvery verejnosti v technológiu mRNA a DNA vakcín a maximalizáciu globálneho úsilia o imunizáciu.

Financovanie

Táto štúdia bola vykonaná v reakcii na formálnu žiadosť slovenského premiéra Roberta Fica, podanú prostredníctvom Úradu splnomocnenca pre Slovenskú republiku, o posúdenie obsahu nukleových kyselín vo viacerých šaržiach vakcín Spikevax a BNT162b2.

IRB

Nie je potrebná žiadna inštitucionálna revízna komisia.

Konflikt záujmov

Autori vyhlasujú, že nedošlo ku konfliktu záujmov.

Dostupnosť údajov

Ďalšie údaje sú k dispozícii, ak sa to v žiadosti o predloženie uzná za vhodné, vrátane, ale nie výlučne, jednotlivca (jednotlivcov) a inštitúcie (inštitúcií), účelu/zámeru žiadosti a relevantných požadovaných informácií, ktoré autori považujú za relevantné. https://www.flemingmethod.com/

Poďakovanie

Tento výskum sa uskutočnil po tom, ako slovenský premiér Robert Fico vymenoval Dr. Kotlára za splnomocnenca a vydal pokyn na posúdenie reakcie Slovenska na pandémiu COVID-19, ako aj po žiadosti ministra zdravotníctva a sociálnych vecí Roberta F. Kennedyho ml. o transparentný výskum a publikovanie.

Referencie

1. Fleming RM (1999) Kapitola 64. Patogenéza cievnych ochorení. Učebnica angiológie. John C (ed.). Chang Editor, Springer-Verlag New York, NY, USA Číslo strany: .787-798.
2. Fleming RM (2000) Flemingova zjednotená teória cievnych ochorení: súvislosť medzi aterosklerózou, zápalom a bakteriálne zhoršenou aterosklerózou (BAA). Angiol 51: 87-89.
3. Fleming RM, Fleming MR (2021) FMTVDM Kvantitatívne nukleárne zobrazovanie nachádza tri spôsoby liečby SARS-CoV-2. Biomed J Sci Tech Res 33: 26041-26083. https://biomedres.us/fulltexts/BJSTR.MS.ID.005443.php
4. Európska agentúra pre lieky (2011) Usmernenie k používaniu DNA vo vakcínach a produktoch génovej terapie: EMA/CHMP/BWP/814397/2011. Európska agentúra pre lieky.
5. S. Food and Drug Administration (2010) Pokyny pre priemysel: Charakterizácia a kvalifikácia bunkových substrátov a iných biologických materiálov používaných pri výrobe vírusových vakcín na prevenciu a liečbu infekčných chorôb. US Food and Drug Administration, USA.
6. Databáza GenBank. Referenčný genóm SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1. Prístupové číslo GenBank: MT192773.
7. Databáza GenBank. Sekvencia mRNA Spikevax (Moderna). Prístupové číslo GenBank: OK120841.
8. Databáza GenBank (2024) Sekvencia mRNA BNT162b2 (Pfizer). Prístupové číslo GenBank: OR134577.

---

Citácia:  Fleming RM, Kotlár P, Pekova S (2024) Kvantitatívna analýza obsahu nukleových kyselín v šaržiach vakcín proti COVID-19 Spikevax (Moderna) a BNT162b2 (Pfizer). J Angiol Vasc Surg 10: 124.

Autorské práva: © 2025 Richard M Fleming, PhD, MD, JD a kol. Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný podľa podmienok licencie Creative Commons Attribution License, ktorá povoľuje neobmedzené používanie, distribúciu a reprodukciu v akomkoľvek médiu za predpokladu, že je uvedený pôvodný autor a zdroj.

Kotlár dodal médiám vedeckú štúdiu o obsahu DNA v covid-génových experimentálnych vakcínach